Le interferenze nel LAL test: soluzioni

I FATTORI DI INTERFERENZA NEL LAL TEST

Il LAL test permette di rilevare la presenza di endotossina batterica in prodotti farmaceutici, acqua per dialisi, medical devices ecc. Il test si basa su una reazione a cascata enzimatica che viene attivata dall’endotossina batterica presente nella parete cellulare dei batteri gram- ma per garantirne il buon esito è fondamentale evitare la contaminazione e le interferenze, per questo si utilizzano consumabili.

Le più comuni fonti di interferenza nel LAL test sono:

• Consumabili non adeguati

• Acqua non adeguata

• Caratteristiche del prodotto da analizzare

............................................................

Consumabili per LAL test

Si tratta per lo più di:

• Provette di vetro o plastica

• Pipette di vetro o plastica

• Puntali di plastica

• Contenitori di vetro o plastica

PROVETTE DI VETRO

Sono molto importanti in quanto usate in tutte le fasi del test: il campionamento, le diluizioni e infine il test vero e proprio.

Le provette per campionamento e diluizione sono di borosilicato. Le provette per il test sono di borosilicato oppure di soda vetro e per la scelta occorre seguire le indicazioni del produttore del reagente LAL. Il borosilicato è un vetro neutro che, a differenza della soda vetro, non rilascia ioni. Le provette possono essere usate più volte, dopo averle depirogenate con calore secco.

Prima della depirogenazione le provette devono essere lavate e sciacquate con acqua apirogena, in modo da evitare la persistenza di detergenti o altre sostanze che interferiscono con il LAL test. Le provette certificate hanno contenuto endotossinico inferiore a 0,001 EU/ml.

PIPETTE DI VETRO

Le pipette apirogene di solito sono di borosilicato, certificate con contenuto endotossinico inferiore a 0,001 EU/ml.

ACCESSORI DI PLASTICA

Parliamo di contenitori, provette, pipette, puntali e micropiastre. E’ necessario usare accessori certificati oppure verificare che la plastica sia priva di endotossina e non interferente per poterla utilizzare nel LAL test. Esiste in commercio plasticheria apirogena certificata con contenuto endotossinico inferiore a 0,001 EU/ml, ma più spesso con contenuto inferiore a 0,005 EU/ml o 0,5 EU/device.

I fattori che possono avere un ruolo nelle interferenze sono:

• Tipo di plastica

• Trattamento

• Microstruttura

Tipo di plastica

Il polipropilene e il polietilene possono inibire il LAL test.

Trattamento

La presenza di additivi quali stabilizzanti, coloranti e antiossidanti può influire sul LAL test così come il tipo di sterilizzazione: tracce di ossido di etilene possono inibire il LAL test. Vi può essere contaminazione successiva alla produzione, ad esempio durante la fase di imballaggio.

Microstruttura

La porosità influisce trattenendo le particelle di endotossina e inibendo il LAL test.

Controlli sui materiali

Il tempo di contatto col prodotto sotto esame è importante. Per verificare che il materiale non sia interferente si può analizzare con il LAL test dell’acqua LAL tenuta per 60 minuti a 37°C nel contenitore da analizzare. L’esecuzione dei controlli positivi è fondamentale per verificare se c’è inibizione.

Particolarmente importante per:

• Contenitori per raccolta e conservazione di acqua e campioni.

• Provette per diluizioni di endotossina standard.

• Micropiastre per test cinetico.

Per pipette e puntali di plastica eventuali interferenze sono limitate dal brevissimo tempo di contatto tra plastica e campione.

..............................................

Acqua per LAL test

Si tratta di un elemento fondamentale per la buona riuscita del test. Anche l’acqua per LAL test deve essere apirogena e priva di fattori interferenti.

I metodi usati per la depirogenazione dell’acqua sono la distillazione (almeno tripla) e l’osmosi inversa.

L’acqua LAL di solito è certificata con un contenuto endotossinico inferiore a 0,001 EU/ml e può essere in bottiglia di vetro o plastica.

Le possibili sostanze interferenti presenti nell’acqua sono:

Sostanze inibenti

I.1) Ioni come ad esempio cloro, ferro, alluminio e rame: presenti nell’acqua di rete.

I.2) Sostanze che influenzano il pH: i problemi di pH sono frequenti dopo la pulizia del sistema e dopo la rigenerazione delle resine.

I.3) Sostanze organiche: formalina o resina degradata.

Sostanze stimolanti

S.1) LAL Reactive Material: glucani derivati da filtri di cellulosa

..................................................................

Caratteristiche del prodotto

Molteplici sono i fattori che influiscono sul LAL test e che possono essere superati applicando determinate strategie o utilizzando reagenti appositi. Per molti prodotti, ad esempio farmaceutici o biotecnologici, la caratterizzazione è la fase in cui si definisce la strategia migliore per eseguire il LAL test, risolvendo eventuali interferenze, e che porta alla stesura della SOP per le analisi di routine.

Fattori con effetto inibente

I.1) pH fuori del range 6.0 - 8.0

I.2) Presenza di agenti chelanti

I.3) Eccesso di ioni

I.4) Presenza di proteine

I.1) pH fuori dal range 6.0 - 8.0

Tipo di interferenza: inibizione.

Risoluzione: correzione con tamponi specifici, NaOH o HCl.

La correzione del pH va fatta seguendo le raccomandazioni del produttore del reagente LAL.

I.2) Presenza di agenti chelanti

Tipo di interferenza: inibizione. Sostanze come ad eparina e citrato sequestrano gli ioni bivalenti Ca++ e Mg++, essenziali per la reazione LAL-endotossina.

Risoluzione: correzione con tampone Tris 1.0 M con MgSO4.

I.3) Eccesso di ioni

Tipo di interferenza: inibizione.

Risoluzione: diluizione del prodotto con acqua LAL.

I.4) Presenza di proteine

Tipo di interferenza: inibizione dovuta all’affinità tra le proteine nel prodotto e il lipopolisaccaride purificato usato per i controlli. Ad esempio il siero

Risoluzione: diluizione del prodotto con un agente surfattante che disperde le proteine o trattamento termico che denatura le proteine.

Fattori con effetto stimolante

S.1) Presenza di componenti di origine polisaccaridica

S.2) Presenza di aggregati di proteine

S.1) Componenti di origine polisaccaridica

Tipo di interferenza: stimolazione, attivazione della reazione tramite la via alternativa del fattore G.

I glucani agiscono in sinergia con l’endotossina batterica. Poiché sono potenti attivatori del LAL,

sono stati chiamati LAL Reactive Material.

Risoluzione: diluizione del reagente LAL con un tampone che blocca la via alternativa.

Il lisato è così sensibile solo alla presenza di endotossina batterica.

La struttura dei glucani

I glucani sono omopolimeri di glucosio. Sono stati trovati in funghi, lieviti, alghe e batteri, ma anche in cotone, filtri e membrane di natura cellulosica. Antibiotici e farmaci entrati in contatto con filtri e membrane di cellulosa possono contenere glucani. Anche mannani, destrani e peptidoglicani possono stimolare il LAL test.

S.2) Presenza di aggregati di proteine

Tipo di interferenza: stimolazione dovuta all’attivazione della reazione da parte di aggregati di proteine ad alto peso molecolare. Ad es. antibiotici.

Risoluzione: diluizione del prodotto con un agente surfattante che disperde le proteine.

................................................................

LAL test su Medical Devices

Gli oggetti di materiale plastico possono mostrare le stesse interferenze viste nelle sezioni precedenti.

Il LAL test viene eseguito sull’acqua utilizzata per il risciacquo dei medical devices e di solito i grandi volumi utilizzati diluiscono le eventuali interferenze.

La preparazione dell’eluato o estratto varia da device a device. Alcuni device possono essere risciacquati, altri immersi mentre altri necessitano il disassemblamento. Norme specifiche, come la USP 27, 2011, Capitolo 161 danno indicazioni sui volumi per il risciacquo. Ad esempio si prende un campione costituito da 10 unità ognuna delle quali va sciacquata con 40 ml di acqua LAL oppure, per device particolarmente piccole o grandi, la superficie che va a contatto col paziente può essere usata per aggiustare il volume di risciacquo o estrazione. La procedura non deve portare a una diluizione maggiore a quella racomandata nel capitolo USP 85. Per il test delle interferenze vanno testati sia la soluzione usata per il risciacquo/estrazione sia l’eluato/estartto dalla device.