Endotossine per convalida del processo di depirogenazione

Premessa:

Kairosafe è distributore di articoli per l'esecuzione del LAL test, intesi sia come reagenti che come strumentazione e consumabili. I nostri Product Specialist sono a disposizione per informazioni tecniche sui prodotti e sulle procedure del LAL test.

PIROGENI E IMPORTANZA DEL LAL TEST

Le endotossine batteriche sono lipopolisaccaridi (LPS) rilasciati dalla membrana dei batteri Gram negativi, e rappresentano le sostanze pirogene più comuni e rischiose in ambito farmaceutico. Per questo motivo i prodotti iniettabili ed i dispositivi medici che entrano in contatto con il circolo sanguigno devono essere sottoposti al LAL test per garantire bassi livelli di pirogenicità.

Sia in fase di produzione sia nel prodotto finito, il contenuto endotossinico deve rientrare in determinati limiti di accettabilità definiti dalla EP Farmacopea Europea armonizzata.

Non solo, anche tutti i consumabili utilizzati nel test delle endotossine batteriche, il LAL test, devono essere privi di endotossine o apirogeni.

METODI DI DEPIROGENAZIONE

La depirogenazione è il processo di eliminazione delle sostanze pirogene e, considerando le caratteristiche del prodotto, può essere ottenuta tramite rimozione o inattivazione.

• La rimozione dei pirogeni si effettua con cromatografia a scambio ionico (ad esempio per albumine), ultrafiltrazione (per soluzioni) e distillazione o osmosi inversa (per l’acqua iniettabile e solventi a basso peso molecolare).
• L’inattivazione si ottiene con idrolisi (per prodotti non proteici) oppure, per materiali come metallo e vetro o altri materiali non termosensibili, con lavaggi e trattamento ad alte temperature (depirogenazione a calore secco) metodo sul quale ci soffermiamo di seguito.

La sterilizzazione non si dimostra sufficiente a distruggere i pirogeni, che anzi possono derivare proprio dalla lisi della cellula batterica, facendo quindi aumentare il contenuto endotossinico.

LA DEPIROGENAZIONE CON CALORE SECCO  - FARMACOPEA EUROPEA

Il trattamento in forni o tunnel ad alte temperature è ideale per depirogenare la vetreria o altri materiali non termosensibili. Seguendo la Farmacopea, occorre applicare un ciclo di almeno 250°C per 30 minuti (sono possibili anche altre combinazioni con un minimo di 180°C per 3 ore) ma convalidato per il proprio utilizzo specifico.

La convalida prevede la verifica di parametri fisici, come tempo e temperatura, e di parametri biologici, cioè la capacità di provocare un abbattimento del contenuto endotossinico di almeno 3 logaritmi (es. abbattimento da 10.000 EU a 10 EU).

Per dimostrare l’abbattimento, si usano appositi indicatori endotossinici (o endotossine da forno), che vengono sottoposti alla depirogenazione e successivamente al LAL test per ricavarne il contenuto endotossinico residuo rispetto alla condizione iniziale e quindi l'abbattimento.

CONVALIDA DEL PROCESSO DI DEPIROGENAZIONE CON ENDOTOSSINE DA FORNO

INDICATORI ENDOTOSSINICI / ENDOTOSSINE DA FORNO

La convalida dei processi di depirogenazione serve a determinarne l’efficacia e si esegue con l’ausilio di endotossine da forno, ovvero quantità note di LPS ottenute per esempio da Escherichia coli O55:B5 o O113:H10:K.

Sono disponibili due tipologie di indicatori:

• Flaconcini con quantità ridotte di endotossina (es. 1.000 o 10.000 EU). Da aprire e usare direttamente come oggetti test da sottoporre al processo.
• Flaconcini con elevata quantità di endotossina (es. 10 milioni EU). Da reidratare e aliquotare in provettine o sugli oggetti test in modo che la contaminazione iniziale sia di 10.000 EU. Questa scelta, un po’ più laboriosa, consente di verificare l’effetto depirogenante direttamente sul prodotto in esame ed è preferibile per oggetti con struttura complessa o per validazioni corpose.

Una volta scelto l’indicatore, se ne prepara un numero adeguato: in genere si utilizzano 10 oggetti test per ciclo, di cui uno rimane non trattato (controllo positivo). Gli indicatori devono essere posizionati nei punti critici del forno o del tunnel, per simulare la condizione peggiore, e sottoposti al ciclo di depirogenazione. In seguito, gli oggetti test vengono analizzati con il LAL test: l’oggetto test non depirogenato funge da riferimento per determinare se è avvenuto l’abbattimento endotossinico atteso.

VERIFICA DELL'ABBATTIMENTO CON LAL TEST GEL-CLOT

La procedura descritta di seguito si riferisce al LAL test eseguito utilizzando un lisato con sensibilità 0,125 EU/ml (λ) su due flaconcini pronti all’uso da 10.000 EU, di cui uno depirogenato e uno no, che funge da controllo positivo.

Il risultato atteso è una differenza di almeno 3 logaritimi tra i due campioni, cioè il flaconcino depirogenato deve avere un contenuto endotossinico residuo minore a 10 EU/ml.

Ricostituzione endotossine da forno

I due flaconcini vengono ricostituiti con 1 ml di acqua LAL apirogena ciascuno e sottoposti ad agitazione su vortex per 30 minuti a intermittenza. Questa fase è particolarmente critica, in quanto un mescolamento inadeguato può comportare un recupero solo parziale dell’endotossina, alterando il risultato finale della convalida.

Si procede alla diluizione scalare in acqua LAL, fino ad arrivare alla concentrazione endotossinica corrispondente a λ/4 (0,125/4=0,03).

LAL Test sui campioni di endotossina da forno

Il LAL test si esegue su ogni diluizione scalare della serie, del campione depirogenato (D) e del controllo positivo (ND). Vengono rispettate le condizioni operative standard:

• controlli negativi costituiti da acqua LAL
• miscela di reazione costituita da 0,1 ml di campione + 0,1 ml di lisato
• due repliche per ogni campione
• incubazione a 37°C per 60 min
• risultato positivo (+): gel fermo dopo capovolgimento della provetta a 180°
• risultato negativo (-): gel non si forma o si rompe dopo capovolgimento della provetta a 180°.

Calcolo dell’abbattimento endotossinico

La prima diluizione che dà risultato positivo corrisponde al cosiddetto “endpoint”. La quantità di endotossina presente nei flaconcini si ottiene moltiplicando il fattore di diluizione dell’endpoint per la sensibilità del lisato:

Contenuto endotossinico ND > endpoint ND x 0,125 EU/ml

Contenuto endotossinico D > endpoint D x 0,125 EU/ml

L’abbattimento endotossinico deve essere di almeno 3 logaritmi per convalidare il ciclo di depirgenazione.

FAQ

CSE (Control Standard Endotoxin) e le endotossine da forno sono la  stessa cosa?

No, non sono la stessa cosa anche se la CSE può essere usata anche per la convalida dei processi di depirogenazione

E' disponibile la procedura del LAL test per la convalida delle depirogenazione?

Sì, è a disposizione dei nostri clienti LAL

Si può usare anche il LAL test cinetico?

Sì

È preferibile usare le endotossine in flaconcini già pronti all'uso o in flaconcini da aliquotare?

La scelta dipende dal fatto che il carrier dell'endotossina deve essere rappresentativo dei materiali oggetto della depirogenazione

PRODOTTI CORRELATI

BOLLINI PER DEPIROGENAZIONE

Nell'ambito della depirogenazione con calore secco, è possibile identificare gli oggetti sottoposti al processo usando appositi bollini a viraggio di colore.