CONSERVAZIONE DEI MICRORGANISMI. CEPPOTECHE

Introduzione

I laboratori microbiologici utilizzano una vasta gamma di ceppi microbici previsti dalle normative per il controllo qualità dei terreni di coltura, per la ricerca, l’insegnamento e per molteplici metodi standard di analisi.
Le colture di microrganismi sono chiamate con vari sinonimi, ad esempio ceppi di controllo, colture standard, ceppi di riferimento, ceppi per il controllo qualità ecc..
Una delle pratiche più comuni prevede la realizzazione di ceppoteche interne al laboratorio, volte a ottimizzare la disponibilità dei ceppi e l’economicità degli stessi. La sfida principale del mantenimento di microrganismi consiste però nella conservazione delle originali caratteristiche genetiche e fenotipiche, evitando le contaminazioni, l’invecchiamento delle colture e le variazioni genetiche.

Le collezioni

I ceppi microbici puri di riferimento sono depositati in collezioni di colture microbiche presenti in tutto il mondo e che offrono, oltre ai microrganismi, anche servizi di mantenimento, conservazione, identifi cazione, classifi cazione, nomenclatura. Ci sono collezioni specifi che per batteri, funghi, lieviti, microalghe ecc.
Le principali collezioni sono ATCC (American Type Culture Collection Centre), DSMZ (Deutche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen), NCTC (National Collection of Type Culture), BCCM (Belgian co-ordinated collections of microorganisms), MUCL (Industrial Fungi and Yeast Collection- Mycothèque de l’Université catholique de Louvain, CECT (Colección Espanola de Cultivos Tipo), a cui seguono molte altre collezioni internazionali.
Le collezioni forniscono microrganismi in forma liofi lizzata o vitale, da poter utilizzare come base per la propria ceppoteca, e in commercio esistono poi varie aziende specialiste che forniscono ceppi liofilizzati in formati di facile fruizione.

Occorre anche ricordare che esiste il catalogo WDCM (World Data Centre for Microrganisms) che raccoglie 191 ceppi di 39 collezioni, contrassegnandoli in modo da facilitare l’accesso ai microrganismi di riferimento elencati nella pubblicazione “Handbook of Culture Media for Food and Water Microbiology” (ISO TC 34 SC 9 Joint Working Group 5, Working Party on Culture Media of the International Committee on Food Microbiology and Hygiene (ICFMH-WPCM).
In sostanza, ai ceppi è assegnato un numero WDCM che si aggiunge, fungendo da collegamento trasversale, ai codici identifi cativi che ogni ceppo ha nelle varie collezioni di riferimento.

Principali tecniche di conservazione

L’obiettivo principale consiste nel mantenere la vitalità e la stabilità genetica della coltura, rallentandone il metabolismo ed estendendo il periodo previsto per le subcolture. Metodi principali:

-       Eseguire subcolture regolari su terreni freschi.

-       Stoccare i ceppi su slant agar a T di 4°C per brevi periodi.

-       Conservare la cryovial in freezer o in azoto liquido con aggiunta di glicerolo o DMSO per lunghi periodi.

-       Liofilizzare la coltura in ampolle per stoccaggio a lungo termine.

Seed Lot Technique

Questo termine è utilizzato nella USP, così come in altre normative e pubblicazioni. Si tratta di un metodo utile e consigliato per la preparazione di una coltura di lavoro pura e incontaminata e per il corretto mantenimento di una ceppoteca.
Uno dei punti fondamentali è che la coltura di lavoro non deve avere più di 5 passaggi, ma cosa signifi ca passaggio? Il passaggio è la subcoltura del ceppo, ossia la crescita su un nuovo terreno.
Partendo dalla coltura di riferimento a passaggio zero, che proviene dalla collezione, essa viene rivitalizzata e fatta crescere. Questa crescita costituisce il primo passaggio. La coltura stock così generata può essere utilizzata per produrre altre colture stock, conservandole ad esempio in freezer, o colture di lavoro. Il passaggio successivo si ha quando la coltura stock viene prelevata, ad esempio dal freezer, e strisciata per farla crescere.

Controllo qualità

È fondamentale istituire un efficace programma di controllo qualità per assicurare la vitalità, la purezza e la stabilità fenotipica e genetica dei ceppi conservati. E’ opportuno verifi care la purezza e l’identità del ceppo prima di porre le colture in ceppoteca.

Protect per la crio-conservazione dei ceppi microbici

Per facilitare la conservazione a lungo termine e a basse temperature dei ceppi microbici, si può utilizzare il sistema originale Protect, costituito da perline di ceramica porosa immerse in una soluzione crio-preservante, sviluppata per nutrire le cellule in sospensione e prevenire i danni da congelamento.
I microrganismi, messi a contatto con le perline, vi aderiscono saldamente e sono poi posti in freezer. Ogni provetta consente di ottenere circa 20 aliquote di microrgansimi, che di per sé non costituiscono un passaggio.

La preparazione è molto semplice: si preleva una densa ansata del ceppo microbico e la si introduce nella provetta Protect, si agita bene affinché i microrganismi aderiscano alle perline, si rimuove il liquido crio-preservante e si pone nel freezer a -20°C, -70°C, -80°C o in azoto liquido. In breve tempo si ottiene una ceppoteca ben identifi cabile grazie ai diversi colori dei tappi delle cryovials e delle perline.
Il recupero del microrganismo è altrettanto semplice: si estrae una cryovial dal congelatore, ponendola nell’apposito cryoblock per il mantenimento della temperatura, con l’ausilio di un ago sterile si preleva una perlina, che viene direttamente strisciata su un terreno agarizzato o inserita in un brodo colturale e poi incubata.

Protect Select

Protect Select nasce dalla specializzazione del Protect multiuso e offre all’utilizzatore la possibilità di rispondere a esigenze particolari nell’ambito della conservazione di microrganismi.
Protect Anaerobi, Caseari e Funghi/Lieviti forniscono formulazioni uniche, messe a punto per il recupero ottimale di specifi che categorie di microrganismi. Meat Free è privo di carne ed è accompagnato da documenti di sicurezza e tracciabilità TSE free, cruciali per i prodotti farmaceutici e biotecnologici, specialmente se per uso intravenoso.

Anaerobi
- Migliora la vitalità e le performance
- Riduce la permeabilità all’ossigeno
- Nutre e mantiene l’ambiente e riduce la perdita di cellule
- Può essere utilizzato anche per organismi esigenti diversi dagli anaerobi
Caseari
- Basato su formulazioni e raccomandazioni BSI/ISO
- Conservazione dedicata di microrganismi isolati dal latte e prodotti caseari, acque di risciacquo e campioni ambientali
Funghi e lieviti
- Semplifi ca la sospensione di spore fungine per mezzo di una formulazione cattura-spore
- Migliorata formulazione per il nutrimento di cellule fungine
- pH neutro per migliorare la stabilità cellulare
Meat Free
- Fornisce al settore farmaceutico e biotecnologico la garanzia BSE/TSE free
- Prodotto con ingredienti vegetali certifi cati
- Conservazione di microrganismi di valore utilizzati da produttori farmaceutici
- Adeguato per la conservazione di microrganismi trasformati/plasmidi

 

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